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Offre de thèse - Exposition aux polluants environnementaux et conséquences neuropathiques

  • Recherche,
  • Santé-Sciences-Technologie,
  • Santé-social,
Date(s)

du 11 février 2020 au 24 avril 2020

Sous la direction scientifique des Profs. Augé-Gouillou et Stéphane Mortaud (Université d'Orléans)

Exposition aux polluants environnementaux et conséquences neuropathiques

Résumé

Depuis plusieurs décades, le nombre de neuropathies survenant chez l’adulte (maladie d’Alzheimer, syndromes autistiques, SLA) (Demetriou et al 2017) est en nette augmentation et la majorité des cas cliniques ne sont pas d’origine familiale. De manière concomitante, l’incidence des Glioblastomes de grade IV (GBM, la tumeur du cerveau la plus agressive) n’a cessé d’augmenter. Si l’amélioration des méthodes de diagnostics et le vieillissement de la population peuvent en partie expliquer ces augmentations, des facteurs extrinsèques, en particulier environnementaux, doivent également être recherchés. L’équipe de S. Mortaud a déjà démontré (Herzine et al 2016) que le Glufosinate Ammonium (GLA) administré à des souris gestantes à faibles doses induit des troubles du comportement assimilables à des troubles autistiques chez la descendance ; par ailleurs, l’analyse de grandes cohortes d’agriculteurs du Nebraska utilisant de fortes doses d’herbicides et d’insecticides montre une nette augmentation du nombre de GBM dans ces populations, en particuliers chez les agriculteurs (Lee et al 2005, Baldi et al, 2010). Ces études de terrain doivent être consolidées et approfondies.

Dans ce contexte, l’objectif du sujet de thèse proposé sera d’évaluer l’impact de trois polluants environnementaux présents en Région Centre administrés à faible dose, seuls ou en cocktail, sur le développement du système nerveux central en analysant le devenir de cellules souches neurales ou cancéreuses. Notre hypothèse est que l’imprégnation en période prénatale ou périnatale des cellules souches neurales favorise l’apparition de neuropathies chez le futur adulte, et, parallèlement, l’imprégnation des cellules souches cancéreuses augmente le risque de survenue du cancer.

Thématique

Les thématiques sont celles des deux équipes de recherche qui accueilleront le doctorant, à savoir la neuro-génomique et la physiopathologie neuronale pour l’équipe 2 d’iBrain (Tours) et la vulnérabilité du système nerveux aux facteurs environnementaux au cours du développement, suite à l'exposition chronique et à faibles doses de xénobiotiques pour l’équipe 4 d’Inem (Orléans).

Domaines/disciplines

Génétique et épigénétique, biologie cellulaire, développement (en particulier du système nerveux central), cancer. Dans les deux équipes, le cœur du modèle sera la cellule souche et son devenir en présence de polluants environnementaux : cellule souche cancéreuse (Glioblastome) pour l’équipe Tourangelle, cellule souche neuronale pour Orléans.

Objectifs

L’objectif global du sujet proposé sera d’évaluer l’impact de trois polluants environnementaux présents en Région Centre administrés à faible dose, seuls ou en cocktail, sur le développement du système nerveux central. De manière plus précise, notre but est d’identifier les gènes dont la dérégulation conduit à perturber la différenciation de cellules souches dans deux modèles complémentaires : des cellules souches cancéreuses humaines (cellules souches de Glioblastome) et des cellules souches neurales chez la souris. Chez l’homme, l’approche sera également épigénétique, et concernera le réseau SETMAR, une protéine spécifique des primates supérieurs. La synergie des deux approches doit permettre d’identifier des gènes cibles des polluants étudiés, notre hypothèse étant qu’ils sont probablement des gènes clés du développement du système nerveux central. L’exposition à ces polluants pourrait être un facteur déclenchant des neuropathies considérées, ou alternativement un facteur aggravant agissant sur un fond génétique prédisposant à leur survenue.

Contexte

Trois polluants environnementaux sont suspectés d’être impliqués dans la survenue de désordres neurologiques (Torbick et al 2018, Samsel et al 2013-2014, Suárez-L et al 2018, Walker et al 2017) : la BMAA, cyanotoxine analogue de l’Alanine, le Glyphosate ou GLY, herbicide analogue de la Lysine et la Perméthrine ou PERM, insecticide pyrethrinoïde. GLY et PERM sont des perturbateurs de l’épigénome, suspectés de jouer un rôle dans la survenue de cancers ; l’exposition à BMAA est positivement corrélée à la fréquence de la SLA (Sclérose latérale amyotrophique).

Le projet présenté ci-après décrit le travail qui sera réalisé à Tours, donc sur les relations polluants environnementaux / cellules souches de GBM / acteurs épigénétiques (réseau SETMAR). Il est dimensionné pour tenir compte du fait que le doctorant partagera son temps entre Tours et Orléans.

Nous disposons d’une part de lignées de cellules souches de Glioblastome (CSG) en culture (mises à disposition et caractérisées par des collègues de Lyon et Nice), et d’autre part d’échantillons tumoraux prélevés chez les patients (certains ayant été opérés à Tours, d’autres ailleurs en France). Dans ces modèles, nous avons mis en évidence la prévalence du variant de petite taille de la protéine SETMAR (un facteur épigénétique spécifique des primates supérieurs). De manière intéressante ce variant (appelé S-SETMAR) semble jouer un effet plutôt protecteur puisque les patients qui présentent de grandes quantités de ce variant en zone péri-tumorale ont un meilleur pronostic (Lié et al, en préparation). Le variant S-SETMAR, contrairement à la protéine FL-SETMAR de pleine taille, a perdu ses propriétés épigénétiques

par épissage du domaine Lysine-méthyl-transférase (domaine SET). Les deux formes possèdent par ailleurs un domaine impliqué dans le métabolisme de l’ADN (réparation par NHEJ, décaténation, ligature, fixation spécifique), appelé domaine MAR. La fixation spécifique du domaine MAR à l’ADN se fait via des séquences de 30 pb répétées des centaines de fois dans le génome humain et qui constituent le réseau SETMAR. A travers ce réseau, SETMAR peut moduler l’activité de gènes cibles en modifiant la structure de la chromatine lors de sa fixation. Cette propriété a été clairement démontrée pour la forme pleine taille (FL-SETMAR) dans le cancer colorectal (Tellier et al 2018).

Le sujet proposé a pour objectifs :

  1. d’évaluer l’impact du traitement des CSG par les 3 polluants sur (1) leur survie et leur prolifération, (2) l’expression des variants SETMAR, (3) le fonctionnement du réseau SETMAR (modification du profil des gènes cibles).
  2. de mesurer la quantité de polluants dans les échantillons tumoraux disponibles au laboratoire, pour tenter de corréler marqueurs génétiques et niveau d’occurence de ces polluants.

Méthodes

Les trois polluants seront utilisés seuls ou en cocktail, toujours à faible dose (0.1 et 0.3mMBMAA,30et300μMGLY et0.1et0.3μMPERM)sur2lignéesdeCSG«natives» et sur les lignées dérivées sur-exprimant de façon constitutive S-SETMAR. Celles-ci sont en cours de préparation au laboratoire dans le cadre du travail de thèse d’Oriane Lié.

  • Après traitement (durée variable) les cellules seront testées pour leur survie et leur prolifération par des tests classiques. Leur capacité à se différencier sera évaluée en changeant les conditions de culture et leur aptitude à résister aux cassures double brin de l’ADN sera évaluée après irradiation. Parallèlement, le niveau d’expression des variants SETMAR sera mesuré par Western blot (un anticorps spécifique est disponible).
  • Après avoir sélectionné les conditions pour lesquelles les différences sont les plus importantes (en expression et en approche cellulaire), un RNA-seq sera effectué dans ces conditions versus les cellules contrôle non traitées (collaboration avec l’ENS Paris).
  • Dans ces mêmes conditions, un ChIP-seq sera réalisé avec l’anticorps anti SETMAR pour identifier les gènes sur lesquels la protéine se fixe (collaboration avec l’ENS Paris).
  • Le dosage des polluants dans les échantillons tumoraux sera confié à un laboratoire spécialiste. L’analyse génétique a été réalisée par les services d’anatamo-pathologie des hôpitaux qui ont fourni les échantillons.

Le matériel et les compétences techniques nécessaire à la réalisation du projet sont disponibles et maitrisés au laboratoire. Le doctorant recevra l’aide d’un technicien pour les aspects analyse de séquences et sera incité à suivre des formations pour acquérir une certaine compétence en bio-informatique.

Résultats attendus

Plusieurs « niveaux » de résultats sont attendus.

  • Si les cellules sont sensibles aux traitements, une altération de leurs propriétés/caractéristiques devrait être observée. Les résultats déjà acquis par notre partenaire Orléanais sur des cellules souches neurales « normales » permettent de supposer que tel sera le cas.
  • Si, comme cela est proposé dans l’hypothèse de travail, les traitements aggravent le potentiel tumorogène des CSG, alors le niveau de S-SETMAR (facteur protecteur) devrait baisser. De même, l’analyse en RNA-seq permettra d’établir la liste des gènes dont l’expression est modifiée par les traitements. Cette liste sera croisée avec celle obtenue sur le modèle murin à Orléans.
  • Finalement, le ChIP-seq permettra de vérifier, dans le modèle humain uniquement, si la variation observée de certains gènes est liée ou non à SETMAR, confirmant son implication dans la survenue des cancers chez l’homme.

L’ensemble de ces résultats sera publiable en collaboration avec Orléans. Ce projet de thèse est proposé dans le cadre d’une demande de financement auprès de la FRM (santé et environnement), co-déposée par les deux équipes partenaires. La partie Tourangelle fera également l’objet d’une demande de soutien auprès de la Ligue 37 et de l’ARC.

Références

  • Baldi et al (2010) Neurochir
  • Demetriou et al (2017) Neuroepidemiology2Samsel et al 2014 Lee et al (2005) Ann Surg Oncol
  • Lié et al (en préparation)
  • Samsel et al (2013) Interdiscip Toxicol
  • Samsel et al (2014) Interdiscip Toxicol
  • Suárez-L et al (2018) Stem Cells
  • Tellier & Chalmers (2018) Nucl Acids Res
  • Torbick et al (2018) Neurotox Res
  • Walker & Gore (2017) Front Neuroendocrinol

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Prof. Corinne Augé-Gouillou :